生物鐘是生命有機(jī)體隨晝夜或四季作周期性變化的生理學(xué)現(xiàn)象，對生物適應(yīng)環(huán)境具有重要的意義。然而，在極晝、極夜或低氧環(huán)境條件下，生物節(jié)律可能出現(xiàn)弱化或衰竭現(xiàn)象。已有的研究發(fā)現(xiàn)，在北極地區(qū)馴鹿的生物鐘基因調(diào)控明顯變?nèi)?；但在世界“第三極”青藏高原上，特有動(dòng)物的生物節(jié)律如何變化，仍然缺乏系統(tǒng)的研究。

　　近期，中國科學(xué)院西北高原生物研究所小哺乳動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化與管理學(xué)科組與北京生命科學(xué)研究所、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究共同在Cell Reports 發(fā)表了題為A Highland-adaptation Mutation of the Epas1 Protein Increases Its Stability and Disrupts the Circadian Clock in the Plateau Pika 的研究論文，揭示了低氧誘導(dǎo)因子Epas1影響高原鼠兔晝夜節(jié)律的分子機(jī)制，為生物鐘與低氧信號互作以及其在生物演化上的意義提供了一種可信的解釋。

　　高原鼠兔（Ochotona curzoniae）是青藏高原特有的植食性小哺乳動(dòng)物，對低溫和低氧有極好的適應(yīng)。通過監(jiān)測高原鼠兔體溫與晝夜活動(dòng)節(jié)律，發(fā)現(xiàn)該動(dòng)物的體溫與晝夜活動(dòng)節(jié)律極弱甚至完全衰竭；細(xì)胞和分子層面的生物鐘具有振幅低、節(jié)律紊亂等特征（圖1A-C）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)高原鼠兔的Clock、Bmal1、Cry1/Cry2具有正常的轉(zhuǎn)錄激活/抑制功能，且向小鼠Per2-/-成纖維細(xì)胞回補(bǔ)高原鼠兔的Per2可以重建穩(wěn)定的生物節(jié)律（圖1D–E），說明高原鼠兔核心生物鐘基因的自身功能并無異常。

　　通過與平原哺乳動(dòng)物缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）家族蛋白編碼基因序列的比較，發(fā)現(xiàn)高原鼠兔Epas1基因（編碼Epas1蛋白，又稱HIF-2α）第14個(gè)內(nèi)含子5’端存在一個(gè)特異的G > A的點(diǎn)突變。RT-PCR結(jié)果表明，該突變可改變Epas1 mRNA的剪接方式，增加了72個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄本以及24個(gè)氨基酸蛋白（下稱L-Epas1，未突變的蛋白稱為S-Epas1）。這一突變在弱節(jié)律的高原鼠兔中以雜合形式存在，而在節(jié)律完全衰竭的個(gè)體則以純合形式存在。全局蛋白質(zhì)穩(wěn)定性（Global protein stability, GPS）分析表明，與S-Epas1相比，L-Epas1蛋白在缺氧條件下穩(wěn)定性更高。此外，向家兔、大鼠、小鼠的Epas1蛋白中插入相同的24個(gè)氨基酸片段也會(huì)提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（圖2A-B）。

　　研究人員使用CRISPR/Cas9構(gòu)建了敲入高原鼠兔L-Epas1基因的C57小鼠。將敲入高原鼠兔L-Epas1基因的小鼠的視交叉上核進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)敲入高原鼠兔L-Epas1基因使SCN的生物節(jié)律對缺氧脅迫更加敏感。通過注射AAV病毒使小鼠在SCN特異性表達(dá)高原鼠兔L-Epas1可以使小鼠在低氧環(huán)境下體溫節(jié)律的穩(wěn)定性下降（圖3A），證明Epas1穩(wěn)定性增加會(huì)導(dǎo)致生物節(jié)律的衰竭。

　　將敲入高原鼠兔L-Epas1的C57小鼠在低氧環(huán)境中飼養(yǎng)一個(gè)月后，其體重下降減少、血液中血紅素含量水平較低，且無明顯的心室肥大（圖3B–C）。上述結(jié)果說明，盡管突變的Epas1蛋白可導(dǎo)致生物節(jié)律的衰竭，但也能夠減小心臟的損傷程度，從而解釋了L-Epas1在演化過程中被保留的原因。

　　西北高原所李文靖博士和北京生命科學(xué)研究所劉娜、田紅妮、虞子青、趙海焦為本文共同第一作者，西北高原所張堰銘研究員為本文共同通訊作者之一。該研究得到第二次青藏高原科學(xué)綜合考察研究（(No.2019QZKK0501）和“西部之光-聯(lián)合學(xué)者”等項(xiàng)目的資助。學(xué)科組依托中科院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

圖1. 高原鼠兔的體溫、活動(dòng)和離體細(xì)胞均無明顯節(jié)律，但是其核心生物鐘基因功能正常

圖2. A. 高原鼠兔Epas1基因多態(tài)性 B. 24aa的插入導(dǎo)致Epas1蛋白穩(wěn)定性增加

圖 3. A. SCN過表達(dá)高原鼠兔Epas1的小鼠體溫節(jié)律性變差 B-C. 高原鼠兔的Epas1可以降低低氧環(huán)境對心臟的損傷